Proteomic

Contact details

Principal Investigator

Alberto Pascual BravoAlberto Pascual Bravo

Technician in Charge

Mariló Pastor HerreraMariló Pastor Herrera

Proteomic

  1. Introduction
  2. Techniques
  3. Equipment
  4. Usage rules
  5. Prices
Proteomic

El servicio de Proteómica es una unidad especializada en separación, cuantificación, identificación y caracterización de proteínas en sistemas de interés biológico y biomédico mediante técnicas de electroforesis bidimensional, cromatografía líquida multidimensional y espectrometría de masas. El servicio ofrece asesoramiento científico y soporte técnico tanto a investigadores del IBiS, como a investigadores de otros centros públicos o privados.

Location:Laborario de Usos Múltiples - Planta Baja

Working hours:L-V: De 9:00 a 17:00 *

(*) Those experiments that need time past the established hours could be made prior knowledge of the technician in charge.

  1. Identificación de proteínas o mezclas de proteínas mediante nESI-MS/MS. La espectrometría de masas en tándem ofrece la posibilidad de identificar las proteínas en muestras de complejidad muy variable, desde proteínas purificadas (purificaciones cromatografías, spots de geles bidimensionales) hasta muestras de complejidad variable (bandas mayoritarias de geles SDS-PAGE, fracciones cromatografícas relativamente purificadas, inmunoprecipitaciones, orgánulos subcelulares o extractos totales de células).
  • Digestión enzimática con tripsina de las manchas proteicas a partir de geles de 2-DE o SDS-PAGE (1-D) o proteínas en solución.
  • Selección de precursor y secuenciación de novo (MS/MS).
  • Identificación de proteínas por fragmentación de péptidos mediante espectrometría de masas (nESI-MS/MS).
  • Búsqueda e identificación de la proteína mediante, mediante la(s) secuencia(s) de péptidos (datos MS/MS).
  1. Proteómica Diferencial. Es una técnica de“multiplexado” para la comparación, en un único paso, de hasta ocho muestras distintas. Mediante diferentes tipos de marcaje dependiendo del material de partida y de la técnica a realizar. iTRAQ es un marcaje isobárico diferencial consiste en marcar los péptidos de digestión de una mezcla de proteínas con un reactivo químico. Los péptidos marcados son separados por cromatografía líquida acoplada a ESI y posteriormente analizados por espectrometría de masas. Esta técnica permite realizar análisis comparativos entre cuatro estados distintos (ocho en una nueva versión del producto).
  • Marcaje con etiquetas isobáricas o isotópicas iTRAQ, SILAC, TMT…
  1. Caracterización de modificaciones postraduccionales. Se ofrece el análisis de fosforilaciones, en el cuál se realiza un enriquecimiento de los fosfopéptidos de la muestra mediante cromatografía con TiO2 y análisis mediante espectrometría de masas. Se puede identificar el fosfopéptido y determinar el aminoácido fosforilado.
  1. Proteómica quantitativa.
  • Mediante marcaje con etiquetas isobáricas o isotópicas iTRAQ, SILAC, TMT…
  • Mediante utilización de acuapeptidos (en el caso de proteínas conocidas).
  1. Proteómica dirigida.
  • PRM (Paralell reaction monitoring)
Click on the different equipment for details on features.

AKTA Purifier FPLC System

AKTA es un sistema de cromatografía líquida de alta resolución diseñado para la separación y purificación rápida y fiable de proteínas, con una velocidad de flujo 0,001 -10 ml / min a presiones de hasta 25 MPa.

AKTA Purifier FPLC System

Sistema completo para Electroforesis Bidimensional (Electroforesis 2D), y Electroforesis Bidimensional Ettan–DIGE (Electroforesis 2D-DIGE)

La electroforesis bidimensional es una técnica de alta resolución para la separación de mezclas complejas de proteínas.

Durante la electroforesis bidimensional las proteínas son separadas secuencialmente por dos criterios físicos: en primer lugar en función de su punto isoeléctrico, y a continuación, según su masa molecular. Finalmente las proteínas separadas son procesadas para su tinción (Coomassie o Sypro).

En el caso de la técnica 2D-DIGE, se utilizarán fluoróforos CyDye DIGE La adquisición de imágenes se llevara a cabo en el sistema Typhoon 4100 para escaneado de geles. Posteriormente los spots seleccionados serán identificados por espectrometría de masas.

Sistema completo para Electroforesis Bidimensional (Electroforesis 2D), y Electroforesis Bidimensional Ettan–DIGE (Electroforesis 2D-DIGE)

Sistema integrado de Espectrómetro Q Exactive plus Orbitrap y nano-HPLC Easy-nLC 1000 de Thermo Scientific

Consiste en una cromatografía líquida acoplada a un espectrómetro de masas híbrido formado por dos analizadores, un cuádruplo, acoplado a un analizador de masas electrostático de alta resolución, denominado Orbitrap.  

El sistema de cromatografía permite trabajar a flujos de nanolitros/min en cromatografía multidimensional aconsejable para el análisis automatizado de proteomas complejos.

El analizador Orbitrap ofrece una alta resolución (del orden de 280.000 FWHM) y una mayor sensibilidad que los equipos tradicionales. Esto permite la detección de proteínas que se encuentren en bajas concentraciones así como analizar mezclas de proteínas más complejas y una mayor precisión en la determinación de la masa de los fragmentos analizados.

Dispone de un dispositivo de fragmentación HCD, con un rango de masas de 50 -6000 m/z.

Sistema integrado de Espectrómetro Q Exactive plus Orbitrap y nano-HPLC Easy-nLC 1000 de Thermo Scientific

NORMAS DE PREPARACIÓN y ENVÍO DE MUESTRAS

  • Muestras procedentes de gel.

Los geles se deben preparar con reactivos de grado analítico y agua mili Q. Es importante que el grosor de los mismos no sobrepase 1 mm y que el porcentaje de acrilamida no exceda el 12% (recomendamos 10% de acrilamida). Deben manipularse con extremo cuidado para evitar contaminación con queratinas, que suelen proceder de manos, pelo y ropa de tejido animal, o con otros contaminantes que posteriormente puedan interferir en el análisis mediante espectrometría de masas. Siempre deben incluirse en el gel marcadores de peso molecular. La tinción del gel puede llevarse a cabo con Commassie Coloidal o sypro. Una vez teñidos, los geles se conservan durante algunas semanas en agua mili Q a 4ºC. Los geles así conservados pueden entregarse en el laboratorio junto con una imagen de los mismos donde se señalen aquéllas proteínas que se quieren analizar. El recorte de las bandas o spots se llevara a cabo en el servicio mediante la utilización de una cabina de flujo horizontal para prevenir cualquier tipo de contaminación. Para la escisión debe emplearse material (bisturí, pinzas o puntas desechables recortadas convenientemente) completamente limpio. Una vez recortadas se colocarán en tubos eppendorf de 500 ul cubiertas de agua mili Q perfectamente identificadas, a ser posible con una simple numeración.

  •  Muestras en solución.

Las muestras se enviarán preferentemente liofilizadas, junto con una descripción de las mismas incluyendo procedencia, cantidad aproximada y la composición de la solución en la que estaban (tampones, sales, posibles contaminantes tipo DNA, lípidos, etc.). En caso de no enviarse liofilizadas, además, se incluirá la concentración de proteína y el volumen en el que se encuentra. En este último caso, las muestras deberán enviarse en frío o congeladas. Independientemente del tipo de muestra, es necesario indicar el organismo de procedencia de la misma. Es importante que el usuario advierta de los posibles riesgos que pueda conllevar la manipulación del material, ya sean tóxicos o biológicos, así como de las medidas de seguridad que sean necesarias. Si el material tuviera riesgo de infección deberá manifestarse, explicando las condiciones en que debe ser manipulado.

ENTREGA DE RESULTADOS

Los resultados de los análisis solicitados se enviarán por correo electrónico o se recogerán en el laboratorio de Proteómica.

El plazo de entrega de los resultados dependerá de la saturación del Servicio en cada momento,  así como de las características del análisis solicitado.

For information about fees and charges applicable to our services, please contact: proteomica-ibis@us.es.